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【研究简报】弧菌属PCR检测方法的建立与应用

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弧菌属于弧菌科弧菌属,是一类革兰氏阴性、具极生鞭毛、能运动、无芽孢的短杆状细菌,是引起海、淡水养殖鱼类细菌性疾病的最重要的病原菌之一。第九版《伯杰氏细菌学手册》收录了35种弧菌属细菌,其中的鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、灿烂弧菌(V.splendidus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)、海利斯顿氏菌(Vibrio pelagius)、美人鱼弧菌(Vibrio damsela)、奥氏弧菌(Vibrio ordalii)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)、鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)以及最小弧菌(Vibrio mimicus)等10多种弧菌可以引起鱼类病害,某些种类还会导致人或其他动物发病。因此,如何在临床上对弧菌病进行快速、正确的诊断,对于采取正确的应对措施以控制疾病的发生和进一步发展显得非常重要。

现有的检测方法只能对弧菌属中的1种或者几种弧菌进行诊断,但弧菌种类繁多,因此要确定具体是什么菌种,需要进行多轮鉴定或检测程序,或者研制复杂的多重PCR检测方法,大大地增加了检测成本,延长了检测时间。水产养殖动物疾病防控技术国家地方联合工程实验室首次研究和开发了一种弧菌属所有菌种通用PCR检测方法,用于快速确定水产养殖过程中的弧菌病及其病原。

研究中根据弧菌属细菌(Vibrio spp.)共有的rpoA基因序列,比对和设计了一对PCR引物,使用创伤弧菌( Vibrio vulnificus)、强壮弧菌( Vibrio fortis)、副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus)等多种弧菌作为测试菌株,使用该引物都能扩增出长度为524bp的PCR产物(图1)。
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对建立的弧菌属通用PCR体系进行了特异性测试表明该体系具有极好的检测特异性,只对靶标细菌霍乱弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌有扩增,对嗜水气单胞菌等其他20种参比菌株无扩增(图2)。
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PCR灵敏度测试表明,该方法对靶标DNA的检测灵敏度为58fg/ L(图3),对菌液的检测灵敏度为2.7×102cfu/mL(图4),能够区分该属细菌与其它属的细菌,具有极高的特异性。
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使用建立的方法对分离自南美白对虾的病原菌进行了检验,并结合16S rDNA序列分析,结果显示待检测病原均为弧菌属的细菌(图5、图6),与测序结果一致,说明该检测方法可用于弧菌属细菌的检测和诊断,可为水产养殖过程中的弧菌诊断和监控、研究弧菌病的爆发和流行规律以及后续的疾病防控提供科学依据。
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以上研究结果已发表在《淡水渔业》2015年第3期,第一作者为水产养殖动物疾病防控技术国家地方联合工程实验室生物技术工程师刘衍鹏。


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